中國報告大廳網訊，生物檢測試劑的擴增性能，尤其是酶試劑的生物活性，對螢光定量 PCR 等檢測結果起著決定性作用。隨著分子生物學與醫學領域的快速發展，生物試劑的應用場景不斷拓展，從實驗室延伸至臨床診斷、野外檢測等多個領域。然而，生物試劑中如 DNA 聚合酶、逆轉錄酶等活性成分易受溫度、濕度等環境因素影響，若保藏與運輸條件不當，會導致酶失活、引物探針降解等問題，大幅降低檢測成功率。當前，行業內亟待通過優化保藏技術，實現生物試劑室溫下長時間穩定保藏與非冷鏈運輸，保障檢測結果的穩定性、準確性、特異性和靈敏度，這已成為推動生物試劑行業高質量發展的關鍵課題。以下是2025年生物試劑行業技術分析。
《2024-2029年中國生物試劑行業市場深度研究及發展前景投資可行性分析報告》指出，生物試劑主要包含引物、探針、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA 聚合酶、逆轉錄酶、Mg²⁺等成分，不同成分的低溫保藏要求存在差異。一般合成的引物為乾粉狀，從有機溶劑中乾燥而來，具備無菌、無核酸酶特性，可在室溫或 - 20℃密閉環境下長期保存，而溶解後的 DNA 則需保存在 - 20℃;TaqMan 探針需避光保存以防止螢光基團降解，乾粉狀態下可在 - 80℃保存一年以上，稀釋為液體後需在 - 20℃保存，且要避免反覆凍融;dNTP 由 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 四種基本核苷酸組成，是新 DNA 鏈的組成元件及 PCR 反應必需組分，在常見 PCR 應用中，各種 dNTP 的常用終濃度通常為 0.2 mmol・L⁻¹，一般在 - 20℃保存;DNA 聚合酶、逆轉錄酶等酶製劑屬於生物熱敏性物質，高溫條件下易失活，通常需在 - 20℃保存，且液體形式的酶製劑穩定性較差，保藏周期短，其活性還會受金屬離子濃度、pH 值、溫度等因素影響。
在實際應用中，科學研究常用的商品化生物檢測試劑盒在 - 20℃條件下可保藏 1 年左右，且大部分試劑盒會明確標註反覆凍融次數。生物試劑中的逆轉錄酶、DNA 聚合酶等生物活性物質，必須依賴低溫冰箱進行保藏。實驗數據表明，當酶的儲存溫度為 - 20℃時，可保存 6 個月以上，而在 37℃保藏條件下，隨著時間延長酶活性會不斷下降。若生物試劑中的酶等成分經過較長時間的高溫運輸，或暴露於較高溫環境中，可能導致實驗結果出現假陰性等不良後果;同時，實驗操作人員在保藏試劑過程中若反覆凍融，也會引發較大實驗誤差。因此，為保證酶的活性，必須確保生物試劑在低溫條件下進行保藏與運輸。
鑑於低溫保藏在生物試劑運輸與操作方面的不便，常溫保藏方法逐步發展起來。要維持 qPCR 等生物檢測試劑在常溫保藏和運輸中的生物活性，關鍵在於去除試劑中的水分，減少各反應組分在保藏過程中可能發生的物理、化學變性及降解反應。目前，去除生物試劑中水分的方式主要有兩種：一種是針對一般非生物活性試劑的加熱乾燥處理，但加熱過程可能導致生物活性物質失活;另一種是真空冷凍乾燥技術(簡稱 「凍干」)，該技術先將液態生物試劑冷凍，再將其置於密閉環境中，在近真空條件下使液態水升華成氣態水，從而實現水分去除。
真空冷凍乾燥技術的流程主要包括三個階段：首先是預凍處理，將生物試劑放置在低溫冰箱中，使溶液中的自由水預先冷凍到固態;其次是升華乾燥，在真空條件下通過升華作用去除生物試劑中的固態水，這是凍干過程中水分去除的主要階段，升華乾燥速率會通過影響水蒸氣逸出快慢，進而影響生物試劑的內部結構，升華乾燥完成後仍會殘留 10% 左右的水分，包括自由水和結合水;最後是解析乾燥，在真空條件下通過解析作用去除升華乾燥未除盡的水分，由於結合水的解析需要較高能量和推動力，此階段設置的溫度需在不影響試劑的前提下儘可能高，真空度儘可能低，解析完成後試劑中可能仍存在 1% 左右的殘留水分。
該技術因全程在低溫下進行，能最大程度降低對酶等熱敏性生物活性物質的損害，應用範圍廣泛。實驗數據顯示，經真空冷凍乾燥處理的核酸檢測試劑，在 20℃密封保藏條件下，檢測性能與未凍干液態檢測試劑無明顯差異;全預混草魚呼腸孤病毒 Ⅱ 型一步法凍干檢測試劑，4℃可保存 12 個月，室溫 25℃可保存 3 個月，37℃可保存 15 天，實現了常溫運輸和短時間保存;分枝桿菌核酸檢測試劑預混液經凍干處理後，在 4℃或 20℃保存 1 年，或在 37℃保存 3 個月，仍能保持較高活性;橡樹猝死病核酸檢測試劑凍干後，室溫保存 20 周，活性依舊維持在較高水平。此外，真空冷凍乾燥技術在生物製藥領域應用廣泛，大幅提升了製藥效率，在疫苗研發與生產中也發揮重要作用，如改進水痘減毒活疫苗冷凝分裝工藝製備穩定一致的冷凝疫苗、通過重組慢病毒載體凍干製備無需冷凍保存的病毒基因載體、研髮乳頭狀瘤病毒凍乾粉末疫苗，且該疫苗能實現與市面上人乳頭狀瘤病毒疫苗相同的免疫原性，可常溫儲存和運輸。
不過，真空冷凍乾燥技術也存在不足：生物試劑凍干過程中可能出現擴增性能下降，主要因酶試劑在凍干過程中失活，需添加海藻糖、蔗糖或葡聚糖等凍干保護劑維持生物活性，且保護劑的篩選與驗證對凍干試劑檢測性能至關重要;試劑脫水後有效物質殘留少，呈粉末狀，轉移困難，凍干過程中可能需添加聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或山梨醇等賦形劑，而賦形劑對預混裝試劑檢測性能的影響仍需進一步驗證。
噴霧乾燥技術的原理是通過霧化器將液體分散為細小顆粒，霧滴在乾燥熱介質空間中蒸發水分，最終得到乾粉物質，主要分為三個步驟：一是霧化，利用霧化器將液料霧化形成微小霧滴;二是乾燥，霧滴與熱空氣直接接觸，迅速蒸發乾燥;三是分離，對乾燥顆粒進行分離和收集。目前常用的霧化器主要有壓力式噴霧器、氣流式噴霧器、離心式噴霧器等類型。
噴霧乾燥技術具有顯著特點：霧化後霧滴體積大幅增大，與高溫空氣接觸瞬間可實現 90%~95% 以上的水分蒸發，根據設備差異，乾燥時間可在 5~30 秒內，能實現物料迅速乾燥且不受高溫影響;針對熱敏性物料，在噴霧乾燥時，物料與熱空氣直接接觸，但多數熱量用於蒸發水分，物料溫度不會超過高溫空氣濕球溫度，也不會受高溫空氣影響，能保證質量品質;適用於從高級合成物到化學品的生產，可處理料液固含量在 0~60% 的含固物料乾燥過程，通過調整工藝參數，能高效生產出滿足粉末顆粒大小、形狀、密度、分散性、多態性及流動性等精準特性的高質量粉末。
當前，生化醫療領域產品加工行業常用的真空冷凍乾燥法可能導致生物材料孔層塌陷，影響其理化結構，而噴霧乾燥法可避免這一問題。但現有噴霧乾燥技術的乾燥溫度會對生物試劑活性產生影響，高溫噴霧法及亞高溫噴霧法溫度均大於 60℃，常溫噴霧法進口溫度為 0~60℃，且常溫噴霧法存在乾燥動力小、除濕難度大的問題。因此，在生物試劑保藏方面，噴霧乾燥技術可結合冷凍乾燥，降低乾燥試劑的能耗。除傳統噴霧乾燥技術外，近年來針對不同領域還出現了節能噴霧、冷凍噴霧、納米噴霧和過熱蒸汽噴霧等新型噴霧乾燥技術。其中，噴霧冷凍乾燥技術是近年發展的微粉化新技術，結合了真空冷凍乾燥技術和噴霧乾燥技術的優勢，適用於蛋白質和肽類等性質不穩定成分的微粉化處理，能縮短冷凍和乾燥時間，獲得孔隙率高、生物活性高的粉末產品，在食品、醫藥等領域應用廣泛。例如，利用該技術生產全脂奶粉，可有效縮短乾燥時間，獲得高孔結構奶粉粉體;製備的魚油微膠囊顆粒粒徑集中分布在 117.13~200.06μm，與傳統噴霧乾燥製備的魚油微膠囊產品相比，質量更優。
在醫藥領域，噴霧冷凍乾燥技術常被應用於藥物研究，如研製治療骨質疏鬆症的激素類藥物鮭魚降鈣素;通過優化噴霧乾燥工藝製備柚苷酶固體酶製劑，所得酶製劑中鼠李糖苷酶活力達 19000 U・g⁻¹，酶活總回收率為 78.1%，柚苷酶活力達 4700 U・g⁻¹，酶製劑含水量 6.5%;利用噴霧乾燥技術製備固態植酸酶製劑，植酸酶的酶活回收率可達 80%。噴霧乾燥技術已成為酶製劑乾燥領域應用最廣泛的技術之一，採用噴霧冷凍乾燥技術可生產出生物活性高、可溶性好、粒徑可控的多種產品，在醫藥領域應用前景廣闊。但該技術也存在不足，主要包括能耗高、設備昂貴且體積大、結構複雜、操作不靈活、易粘壁等，後續還需開展該技術對 DNA 聚合酶和逆轉錄酶生物活性影響的研究，為生物試劑保藏提供更多思路。
目前，疫苗、免疫血清、免疫球蛋白、抗原及生物酶等生物製品多以溶液形式生產，這些生物試劑在常溫條件下極易發生蛋白質快速降解，導致生物活性大幅降低。真空冷凍乾燥技術的凍干過程中，試劑需承受多種應力，這些應力常直接或間接導致蛋白質活性不穩定，而玻璃化冷凍技術為解決這一問題提供了新途徑。
玻璃化冷凍技術中的玻璃化，是指在一定降溫速率下，液態物質直接轉變為玻璃化固體狀態的過程，此過程中不會生成晶體結構，還能保持液相時期分子及離子的分布，且在冷凍和解凍過程中不會在液態和晶體之間來回變化，其力學性質與玻璃相似，故稱為玻璃態，這是一種介於液態與固態之間的狀態。發生玻璃化轉變時對應的溫度稱為玻璃化轉變溫度(Tg)，要保持製品的玻璃態，需將其儲存在低於或等於該物質 Tg 的環境中，若製品的 Tg 高於室溫，則有望實現室溫下較長時間的穩定保存。
在蛋白質生物藥物領域，利用玻璃化冷凍技術可延長藥品貯存時間，實現非冷鏈條件下的穩定保藏。例如，加入海藻糖等保護劑，採用玻璃化冷凍技術生產的疫苗，能在極端溫度下保藏;使用海藻糖等凍干保護劑、蛋氨酸和明膠等，通過玻璃化冷凍技術研製的熱穩定減毒活沙門氏菌 Ty21a 細菌疫苗，在 37℃條件下可穩定儲存約 12 周，該技術不僅提高了活 Ty21a 疫苗的溫度穩定性，還增強了產品的免疫原性，有效延長了疫苗保質期，實現了疫苗常溫儲存和運輸，為不發達地區使用疫苗提供了極大便利。
在生物試劑保藏方面，生物酶通常是與甘油按一定比例混合後在低溫條件下保藏，應用玻璃化冷凍技術可改善酶試劑的保藏條件。實驗數據顯示，使用 Ficoll400 和松三糖等試劑研製的玻璃化限制性內切酶，可在室溫或 37℃條件下穩定保藏 4 個月;研製的克隆小鼠白血病病毒逆轉錄酶與 Klenow 酶，可在室溫條件下保藏，且能在 30 秒內復溶於水，研究表明其 Tg 至少為 40℃(45℃為最佳)，才能保證製品在室溫下的穩定性;以海藻糖作為保護劑，利用玻璃化冷凍技術研製的乳酸鹽脫氫酶，可在 60℃條件下穩定保藏 4 周。
玻璃化冷凍技術在玻璃化期間也需添加海藻糖等凍干保護劑，以防止酶結構劇烈變化，維持生物製品高活性，延長穩定保藏時間，降低冷鏈保藏及運輸的經濟成本。該技術目前在細胞與胚胎、組織和器官中的應用也較多，例如對人體大型卵巢組織進行玻璃化冷凍，經形態學分析、凋亡檢測及免疫組織化學方法檢測解凍後的卵泡活性發現，玻璃化組與程序冷凍組在解凍後原始卵泡比例、正常形態及卵泡凋亡率方面無統計學差異，且玻璃化組間質細胞凋亡率低於程序冷凍組。玻璃化冷凍技術具有操作步驟簡便、儲存穩定性好、復甦率高等優勢，此外，在低毒性保護劑濃度和較高降溫速度的前提下優化玻璃化製品的 Tg，即可實現製品常溫儲存，這對該技術的進一步發展和應用具有重要意義。
目前，大部分生物試劑行業仍需依賴專門的冷鏈運輸，相關設備複雜、成本高昂、運輸耗時，對於交通落後地區，難以實現空運。若遭遇重大緊急疫情爆發，很可能因冷鏈運輸資源緊張、運輸費時或疫區交通不便，導致試劑供應不及時。冷凍保藏作為一項重要手段，在生物、醫學領域對生物試劑、細胞或組織等的保藏中仍發揮著重要作用。因此，選擇合適的保藏技術手段，對於生物試劑的運輸、維持活性物質的生物活性、保證檢測質量及穩定性具有重要意義。
隨著分子生物學檢測技術應用日益廣泛，生物試劑保藏問題備受關注，真空冷凍乾燥技術、噴霧冷凍乾燥技術和玻璃化冷凍技術等保藏技術應運而生，實現了生物試劑的常溫穩定保存，解決了生物試劑低溫儲存和運輸的限制。但冷凍乾燥過程中，冷凍階段、乾燥階段以及凍干後的試劑保藏過程相對複雜，其中冷凍階段冰 - 水界面形成、速凍等均可能導致蛋白質變性 / 降解反應增加，不可避免地對生物試劑中部分生物活性物質造成損傷;此外，乾燥階段可能導致酶等蛋白質周圍水分去除後，天然構象發生變化，進而影響其生物活性。
生物試劑中的 DNA 聚合酶可耐高溫，具有高度熱穩定性，凍干後穩定性較易維持;而逆轉錄酶不耐受高溫、穩定性較差，凍干後維持長期保藏的難度較大。同時，生物試劑中的引物、探針為寡核苷酸片段，保藏不當會導致其降解。目前，引物 / 探針凍乾粉形式的生產工藝已相對成熟，廣泛應用於實驗室科研和臨床診斷中，大部分商品化的核酸提取試劑盒(磁珠法)中也使用了可常溫保藏凍乾粉形式的蛋白酶 K，避免了酶在長時間的高溫運輸或者由於操作 / 保藏不當暴露於較高溫度環境下，可能造成實驗結果出現假陰性等不良後果。
商品化的 DNA 聚合酶 / 逆轉錄酶一般需要添加甘油後在 - 20℃低溫保藏，運輸過程依賴冷鏈運輸。目前，核酸檢測試劑多數為酶混合液與核酸擴增反應液分開包裝，部分商品化試劑盒以一管式預混液形式存在，但均為液體形式，無法實現常溫保藏及運輸。而且在 - 20℃低溫保藏條件下，除酶以外多為冷凍固態，實驗過程中需解凍，且試劑的配製較為複雜繁瑣，實驗人員操作不當極易引起試劑漏加、交叉污染等情況，因此正規的核酸檢測實驗室會設置分區，由專業人員進行實驗操作。此外，各反應組分尤其是引物、探針和酶用量較少，對移液器的精準度要求高，且試劑配製完成後需將其混勻或藉助離心機回收吸附在管壁上的液體。
目前，儘管有一些商品化的生物試劑以混合形式存儲在一個反應管中，稱為 「預混裝」，以簡化操作，但這種儲存方式並非每個反應組分的最佳儲存環境，其性能和穩定性也會受到一定程度的影響。例如，保存在 「預混裝」 試劑中的酶可能會因失去甘油的保護而變性失活或降解;引物和探針可能會因稀釋而導致在儲存過程中降解速度高於原本高濃度的 「母液」 形式;此外，「預混裝」 中包含了除核酸模板以外 qPCR 所需的全部成分，可能會引起無模板情況下的非特異性擴增反應。為最大程度地維持酶的生物活性，備選方法是將 PCR 試劑與酶分開儲存，使用 「半預混裝」 的方式，但除酶以外的 PCR 試劑並不能在最優條件下保存，其活性仍然受到一定程度的影響。在操作過程中，雖然試劑添加步驟相對減少，但操作者仍需將酶與 「半預混裝」 試劑混合在一起，且酶的用量非常少，因此仍需依賴精確的移液器進行操作，同時混合之後仍需混勻處理。由此可知，當前生物試劑的保藏技術大部分為低溫儲藏，在低溫保藏條件下，液態生物試劑實驗過程中需要考慮人員的專業性和嚴謹性，且操作步驟較為複雜，一定程度上限制了核酸檢測技術的發展以及在非實驗室檢測環境開展檢測活動。
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